Ученые из США изучили структуру AMPA рецепторов гиппокампа на молекулярном уровне и выяснили, из каких элементов он строится. В связи с тем, что AMPA играет важную роль в процессах потенциации (активации) и депрессии (торможения) нейронов, можно предположить, что все обнаруженные его компоненты представляют собой важные звенья в процессах формирования памяти.
Глутамат — самый распространенный нейромедиатор в центральной нервной системе (ЦНС). Если сравнивать нейроны с человеком, а медиаторы — с языком, то глутамат, несомненно, можно считать аналогом английского языка. Продолжая такие сравнения, отметим, что нейроны “слушают” другие клетки рецепторами. При этом для каждого нейромедиатора приходится по несколько разных видов рецепторов, словно наречий одного и того же языка. Так, чтобы “услышать” глутамат, нейрон может использовать четыре типа рецепторов: AMPA, NMDA, mGlu, каинатные рецепторы.
Что из себя представляют эти рецепторы? Как они выглядит на молекулярном уровне? Мы редко задаемся этим вопросом, чаще всего воспринимая их как некое единое целое, словно на изображении ниже.
Ученые из США решили рассмотреть подробнее нейронные “уши” и исследовали один из рецепторов глутамата — AMPA.
Ионотропный рецептор AMPA (то есть работающий по принципу: подобрали ключ к замку — ворота открылись) — один из важных участников таких процессов как долговременная потенциация и депрессия, лежащие в клеточных основах формирования памяти. У AMPA рецептора очень длинное название: рецептор α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты и не менее сложная внутренняя структура.
Рецептор представляет собой своеобразный комплекс различных компонентов, каждый из которых может повлиять на прохождение ионов через его открытый канал, тем самым изменяя возбуждение/торможение самого нейрона. При том помимо основных компонентов в нем находится множество вспомогательных протеинов и липидов, таких как трансмембранный AMPA регуляторный протеин гамма 8 (сокращенно, TARP-γ8), белки CNIH2 и SynDIG4. В своем эксперименте ученые изолировали естественно полученный AMPA рецепторный комплекс млекопитающего из гиппокампа и рассматривали его с помощью криоэлектронного микроскопа. КриоЭМ — такой тип микроскопии, когда сам изучаемый препарат находится в замороженном состоянии. При этом его можно не окрашивать, тем самым изучая его в обычной окружающей среде. На сегодняшний день этот метод позволяет изучать очень маленькие клеточные объекты, рассматривать митохондрии, рибосомы, вирусы и даже ионные каналы клетки. Вот так выглядят изображения в таком микроскопе:
Исследователи показали, что каждый рецептор нейрона гиппокампа мыши состоит из более чем одной основной субъединицы, которые называются GluA1, GluA2, GluA3, GluA4. Такие субъединицы могут встречаться в разных сочетаниях, и они “разбавлены” вышеупомянутыми протеинами TARP-γ8 и CNIH2.
Внимательно изучив рецептор, ученые убедились, что он похож на букву Y, которая может быть как симметричной (S), так и асимметричной (AS).
Рецепторов, которые состоят только из GluA1 и GluA2 — около 90% (рисунок А). При этом субъединицы этих рецепторов организованы по определенному порядку: А1А2А1А2. Второй по частоте тип конформации AMPA рецептора (GluA1-GluA2-GluA3) составил 36% от оставшегося числа (рисунок Б).
С помощью флуоресценции антител для каждой субъединицы рецептора ученые обнаружили, что содержание GluA1 почти на 60% больше, чем GluA3, а самая распространенная субъединица — это GluA2. В 37% случаев GluA3 находится вместе с GluA1.
Для изучения рецептора ученые “условно” разделили его на четыре уровня, что на изображении отмечено слева названиями: Fab, ATD, LBD, TMD. Первый “этаж” — fragment antigen binding — способствует идентификации антигена для конкретной субъединицы рецептора. Второй уровень — амино-терминальный домен, находящийся во внеклеточной среде и улавливающий элементы других нейронов. Третий уровень — лиганд-связывающий домен. Из названия понятна его основная роль – связывание всех частей рецептора. Четвертый уровень — трансмембранный домен, в котором рецептор встраивается в подвижную среду мембраны клетки. Для успешной работы рецептора необходимо, чтобы все домены были постоянно связаны друг с другом и передавали сигналы между собой.
Каждая субъединица рецептора связана с несколькими регуляторными белками, позволяющими организовать внутреннее взаимодействие в рецепторе. Самый распространенный тип такого белка — TARP-γ8.
Чтобы оценить его количественные соотношения с другими компонентами AMPA, ученые метили с помощью антител соответствующие субъединицы. Так, для каждой субъединицы использовалось подходящее антитело, которое позволяло при последующей флуоресценции определить количество того или иного элемента в определенной зоне рецептора. Оказалось, что вместе с GluA1 и GluA3 локализуется и TARP-y8 в соотношение 65% и 38% соответственно.
Ученые также применили метод называемый молекулярным обесцвечиванием (single-molecule photobleaching). При этом методе происходит активация флуоресценции конкретной молекулы или элемента, из-за чего он переходит в “яркое” состояние, которые затем видно как обесцвечивание конкретных элементов клетки. Это позволяет различать молекулы, которые расположены очень близко за счет их разделения по времени активации и обесцвечивания. Такое переключение может осуществляться в несколько “циклов”, что позволяет детектировать молекулы с большей точностью. Вы можете попробовать сами поэкспериментировать с данным методом в модели.
Исследователи обнаружили после двух циклов обесцвечивания примерно 69% молекул TARP-γ8. График обесцвечивания, представленный ниже, при наложении на график биномиального распределения позволил предположить, что большинство AMPA комплексов содержат как минимум 2 TARP-γ8.
Каждый белок, как известно, состоит из ряда аминокислот, которые в своей структуре формируют спирали.
Не исключение и элементы AMPA рецептора. В составе каждой субъединицы выделяются несколько спиралей: M1 — в качестве первичной спирали, М2 — в качестве вторичной (и так далее) для GluA1 и GluA2, TM1 — TM4 (трансмембранные спирали) для TARP-γ8.
Спирали TM3 и TM4 играют важную роль при взаимодействии рецептора на трансмембранном уровне с другими компонентами, позволяя субъединице GluA1 формировать водородные связи с разными элементами.
Таким образом, вся картина рецептора выглядит несколько более сложным образом, представляя собой множество спиралей, которые взаимодействуют друг с другом на разных уровнях.
Ученые также показали, что другой “вспомогательный” элемент, CNIH2, в избытке содержащийся в гиппокампе, позволяет увеличивать поверхностную экспрессию AMPA, регулируя его активность и замедляет ход постсинаптического возбуждения. Оказалось, что он способствует локальному расширению рецептора на трансмембранном уровне, тем самым является своеобразных “моторчиком” открытия ионного канала.
Оба “вспомогательных” белка (CNIH2 и TARP-γ8) участвуют во взаимодействии спиралей разных субъединиц рецептора.
На рисунке серыми линиями отмечен уровень мембраны, где можно найти оба вспомогательных белка. Там же ученые обнаружили многочисленные липиды, предположительная роль которых состоит в “сборке” всех субъединиц рецептора, своеобразном “рецепторном клее”, позволяющем увеличить плотность рецептора.
На изображении также отмечен элемент JNJ — специфический для конкретной области мозга антагонист AMPA рецептора, зависимый от TARP-γ8. Он находится в каждой точке, где происходит контакт TARP-γ8 и GluA1. Ученые предположили, что этот элемент необходим для увеличения расстояния между элементами AMPA, что позволяет избежать их склеивания и нарушения работоспособности. В противном случае пространство рецептора станет слишком маленьких для того, чтобы связывать нейромедиатор. Вид сверху на рецептор показан ниже, где отмечены практически все основные найденные компоненты.
Наконец, ученые обнаружили неизвестную двойную спиралевидную структуру, ориентированная параллельно спирали M4 GluA1. Они предположили, что это может быть дополнительный вспомогательный белок, например, SynDIG4 — обогащенный пролином трансмембранный протеин 1 (PRRT1). Его количественный анализ показал, что 61% такого белка находится там же, где и TARP-γ8. SynDIG4 располагается параллельно спирали TM1 и часто контактирует с M4 GluA1, видимо, дополнительно регулируя работу данных субъединиц.
Изучение AMPA рецепторов позволило ученым прикоснуться к правилам, по которым субъединицы собираются в единый действующий комплекс рецептора. Структура рецептора позволяет лучше понять его функции, тем самым, давая возможность влиять на него, и, следовательно, в некоторой степени “управлять” памятью. Однако как именно управлять — это большой вопрос для будущих исследований.
Текст: Никита Отставнов
Hippocampal AMPA receptor assemblies and mechanism of allosteric inhibition by Jie Yu, Prashant Rao, Sarah Clark, Jaba Mitra, Taekjip Ha, Eric Gouaux. (2021). Nature.
