В журнале Nature Plants опубликована работа международного коллектива авторов под руководством исследователей из Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, в которой предложен и проверен в генно-модифицированных растениях простой и изящный способ сделать самосветящиеся биологические репортеры устойчивыми к колебаниям метаболизма.
Исследователи создали пары люцифераз, использующих один и тот же субстрат, но излучающих свет разного цвета, и показали, что отношение сигналов двух цветов отражает активность гена-репортера, а не метаболическое состояние клетки.
Таким образом появляется возможность отслеживать фитогормональные и защитные реакции растений на длительных промежутках времени. Мы решили рассказать об этой работе, несмотря на то, что к нейронаукам она не имеет прямого отношения. Но созданный в ней красивый молекулярно-биологический инструмент может найти применение в любой биологической отрасли, в том числе – и в нейро.
Исследование поддержано четырьмя грантами РНФ: 25-44-02157, 24-74-10087, 25-76-30006 и 25-14-00349.
Инженерия грибных люцифераз со сдвигом свечения в красную область. Илл: Morozov V.V., Balakireva A.V., Gao F., Fleiss A., et al. Metabolically robust ratiometric autoluminescent reporters. Nature Plants (2026). DOI: 10.1038/s41477-026-02437-y
Представьте себе, что нам нужно отследить, когда и в какой части растения включается определённый ген — например, связанный с реакцией на нехватку воды. Наблюдать за работой гена непосредственно трудно. Поэтому к его управляющей последовательности можно «подключить» еще один ген, кодирующий люциферазу — белок, отвечающий за свечение в определенных организмах других царств (в природе светящихся растений не существует). Когда эта последовательность активируется, клетка начинает производить такой люциферазу, и появляется световой сигнал. Получается своего рода световой индикатор работы гена. Научное название такого индикатора — репортёр.
Люцифераза в живых организмах светится не сама по себе, ей сопутствует производство люциферина – вещество, которое окисляется при помощи люциферазы и кислорода воздуха с испусканием квантов света. Однако для репортеров люциферин можно добавлять извне.
Впрочем, растения можно генетически изменить так, чтобы они сами производили необходимые люциферины с помощью ферментов, например, светящихся грибов. Такие растения способны светиться без добавления люциферина — это показано в более ранних исследованиях. За создание светящихся растений (и расшифровку механизмов биолюминесценции один из авторов этой работы, Илья Ямпольский, был удостоен в 2025 году национальной премии «Вызов»).
Тем не менее, у «обычного» светового репортера есть несколько проблем. Допустим, растение стало светиться слабее. Возможны по меньшей мере два объяснения: исследуемый ген стал работать менее активно, поэтому светящегося фермента образуется меньше или активность гена не изменилась, но клетка стала производить меньше вещества, необходимого для свечения.
Именно эту проблему решает новая работа.
Идея авторов была изящна и проста: если в одной клетке одновременно экспрессировать две люциферазы, которые используют один и тот же субстрат-люциферин, но светятся в разных диапазонах, то отношение интенсивностей двух цветов будет зависеть в основном от относительного количества этих ферментов, а не от концентрации субстрата или общего метаболического статуса. Одна люцифераза служит «репортером» (ее ген ставят под интересующий промотор), а вторая — «референсом» (под постоянный промотор). Отношение красного и зеленого сигналов дает количественную меру активности промотора.
Чтобы реализовать эту схему, нужно было получить люциферазы, излучающие свет с разной длиной волны, но использующие один субстрат. Для грибного пути биолюминесценции (выделенного из грибов) красных вариантов практически не существовало. Исследователи использовали стратегию BRET — биолюминесцентного резонансного переноса энергии. Они встраивали флуоресцентные белки (tdTomato, mScarlet, mKate2) в различные участки молекулы люциферазы, чтобы энергия от реакции окисления люциферина передавалась на флуорофор и излучалась в красной области.
Сначала авторы просканировали последовательность люциферазы, вставляя и удаляя фрагменты, чтобы найти позиции, толерантные к структурным возмущениям. Затем, комбинируя оптимальные точки вставки, улучшенный вариант люциферазы (Luz533) и оптимизированные линкеры, они получили три варианта: Luz593, Luz608 и Luz640. Все они сохраняли яркость, достаточную для визуализации, и давали заметный сдвиг спектра. Самый «красный» вариант Luz640 имел наибольшее спектральное разделение, но для дальнейших экспериментов выбрали Luz593 и Luz608 из-за более высокой яркости.
Параллельно аналогичную работу провели для бактериальной люциферазы LuxA, создав зеленый (GNLX), желтый (YNLX) и красный (RNLX) варианты.
Сначала исследователи убедились, что введение флуоресцентного белка не дестабилизирует люциферазу: период полужизни Luz593 и Luz608 в клетках BY-2 составил около 9–10 часов, как и у исходной Luz533.
Затем авторы одновременно экспрессировали зеленую и красную люциферазы под сильными конститутивными промоторами и обработали растения тидиазуроном (TDZ) — синтетическим регулятором роста, который грубо вмешивается в гормональный баланс и метаболизм. В контрольных условиях интенсивность свечения могла меняться в несколько раз, но отношение красного сигнала к зеленому оставалось стабильным. В клетках BY-2 с бактериальной системой рациометрический показатель оказался до 16 раз стабильнее, чем просто интенсивность свечения.
Самая впечатляющая часть работы — эксперименты на трансгенных растениях Arabidopsis thaliana. Авторы использовали «мастер-линию», которая синтезирует люциферин, но лишена, собственно, люциферазы. В нее вводили конструкции, где зеленой люциферазой управляли промоторы WRKY70 (участвует в защитном ответе) или ORCA3 (ранний ответ на жасмоновую кислоту), а красная люцифераза служила референсом.
Трехдневная визуализация растений с репортером WRKY70 показала: несмотря на значительные колебания общей интенсивности свечения, отношение сигналов оставалось стабильным в отсутствие индукторов салициловой кислоты. Более того, исследователи наблюдали «мерцающие» паттерны иммунной активности в листьях розетки — и рациометрический сигнал позволял их отслеживать. При обработке ацетилсалициловой кислотой (индуктор защитного ответа) данные люминесценции совпали с результатами измерения транскрипции.
На линии с репортером ORCA3 смоделировали реакцию на заражение бактериальным патогеном Pseudomonas savastanoi. Рациометрическое изображение выявило локальную зону ответа вокруг места инфекции на фоне ярко светящихся жилок, которые сильно варьировали по интенсивности. Без рациометрической поправки такие слабые локальные сигналы было бы трудно различить.
«Мы сумели создать, как мне кажется, красивый метод, в котором соединены механизмы биолюминесценции различных видов, создание более красных вариантов люциферазы грибов путем соединения с флуоресцентными белками и получение трансгенных растений. Этот метод позволяет разделить изменение уровня экспрессии генов и колебания метаболической активности растения. В результате мы получаем инструмент, который может найти применение в функциональной геномике, физиологии стресса, изучении иммунитета растений и биотехнологии», — резюмирует суть исследования одна из авторов работы, научный сотрудник лаборатории химии метаболических путей ИБХ РАН Анастасия Балакирева.
Текст: Алексей Паевский
Morozov V.V., Balakireva A.V., Gao F., Fleiss A., et al. Metabolically robust ratiometric autoluminescent reporters. Nature Plants (2026). DOI: 10.1038/s41477-026-02437-y
