Группа ученых Санкт-Петербургского государственного университета в сотрудничестве с коллегами из СПбПУ и СПбАУ РАН имени Ж. И. Алферова создала метод усиления свечения белков-сенсоров, которые позволяют отслеживать мембранный потенциал клеток. Разработка может быть использована при создании лекарственных препаратов, а также для медицинских исследований мозга и сердца. Результаты исследования, поддержанного грантом РНФ, опубликованы в научном журнале ACS Physical Chemistry Au, а статья размещена на обложке печатной версии издания.
Клеточная мембрана — это особая структура, состоящая из белков и липидов, которая отделяет содержимое клетки живого организма от внешней среды и позволяет сохранить ее целостность. В современной биологии и медицине особое внимание уделяется изучению изменений мембранного потенциала, то есть разницы в электрическом потенциале между внутренней и внешней сторонами клеточной мембраны. Эта разница возникает из-за неравномерного распределения ионов внутри и снаружи клетки.
Изменение мембранного потенциала играет ключевую роль в передаче нервных импульсов, мышечном сокращении и других физиологических процессах, необходимых для функционирования организма. Эта характеристика изменяется при возникновении патологий: например, у раковых клеток этот показатель значительно ниже, чем у здоровых.
Один из способов изучения изменений мембранного потенциала клеток — использование специальных флуоресцентных белков. С помощью методов генной инженерии такие белки вводят в клетку, и они начинают светиться под воздействием света, причем интенсивность свечения определяется величиной мембранного потенциала. Такой подход позволяет наблюдать происходящие в клетке процессы в режиме реального времени, однако из-за слабого сигнала возможности применения флуоресцентных белков-сенсоров ограничены.
Ученые Санкт-Петербургского государственного университета совместно с коллегами из других научно-образовательных организаций нашли способ значительного усиления свечения белков, объединив несколько подходов и используя методы направленной эволюции и компьютерного дизайна.
В своей работе химики исследовали фоточувствительный мембранный белок археородопсин-3, однако используемый подход может применяться и при разработке других белков.
«В предыдущих исследованиях более яркие варианты сенсоров мембранного потенциала на основе археородопсина-3 находили, используя метод направленной эволюции, то есть имитируя процесс эволюции «в пробирке». Мы использовали набор относительно ярких мутантных форм этого белка, полученный ранее, и построили их «цифровые двойники» с помощью методов квантовой химии и биоинформатики. Это позволило определить отличия между разными формами белков и предложить новые, более яркие варианты сенсоров для изучения мембранного потенциала», — рассказал руководитель гранта, доцент кафедры медицинской химии СПбГУ доктор химических наук Михаил Рязанцев.
Как объяснил химик Санкт-Петербургского университета, в процессе направленной эволюции последовательно генерируются «поколения» мутантных форм белков со стохастическим (то есть случайным) распределением аминокислотных замен. На каждом этапе отбираются наиболее «приспособленные» белки, в данном случае белки с наибольшей яркостью свечения. Именно они используются для создания нового поколения. Такой подход позволяет ученым получить «улучшенные» белки даже при отсутствии данных об их структуре и механизмах, которые контролируют те или иные свойства. Однако, как отмечают авторы работы, при таком подходе не всегда удается получить самый оптимальный набор аминокислотных замен — как и в процессе эволюции не всегда формируется оптимальный набор характеристик организма.
Опираясь на результаты компьютерного моделирования, химики СПбГУ определили, какие модификации — аминокислотные замены в белке — позволят усилить яркость свечения. Оказалось, что основное отличие ярких вариантов сенсоров от тусклых заключается в состоянии протонирования двух аминокислотных остатков. Один из них протонирован в ярком состоянии, а другой в тусклом, а переключение происходит за счет переноса протона по «проводу» из молекул воды, которые ученые СПбГУ нашли с помощью методов компьютерного моделирования.
«Полученные нами белки-сенсоры — мутантные формы археоропсина-3 — имеют ряд преимуществ по сравнению с уже известными вариантами. Они обладают значительно более яркой флуоресценцией, для их активации можно использовать «красный» лазер, поскольку нам удалось сдвинуть спектр их поглощения в длинноволновую область. Такое излучение лучше проникает в биологические ткани, что более перспективно для последующего применения этих белков в медицине», — объяснил научный сотрудник кафедры медицинской химии СПбГУ Дмитрий Николаев.
Усовершенствованные варианты сенсоров могут найти применение в биомедицинских исследованиях — в частности, при изучении работы мозга и сердца с помощью флуоресцентного микроскопа. Белки с увеличенным свечением позволяют с помощью специального микроскопа отслеживать даже самые быстрые изменения потенциала отдельных нейронов. Кроме того, разработанные белки-сенсоры могут быть полезны при разработке лекарств для лечения заболеваний мозга, таких как болезнь Паркинсона и эпилепсия, при создании препаратов для терапии сердечно-сосудистых заболеваний, а также для диагностики различных патологий.
Текст: пресс-служба СПбГУ
Rational Design of Far-Red Archaerhodopsin-3-Based Fluorescent Genetically Encoded Voltage Indicators: from Elucidation of the Fluorescence Mechanism in Archers to Novel Red-Shifted VariantsDmitrii M. Nikolaev, Vladimir N. Mironov, Ekaterina M. Metelkina, Andrey A. Shtyrov, Andrey S. Mereshchenko, Nikita A. Demidov, Sergey Yu. Vyazmin, Tatiana B. Tennikova, Svetlana E. Moskalenko, Stanislav A. Bondarev, Galina A. Zhouravleva, Andrey V. Vasin, Maxim S. Panov, and Mikhail N. Ryazantsev ACS Physical Chemistry Au 2024 4 (4), 347-362DOI: 10.1021/acsphyschemau.3c00073
